Producción y caracterización bioquímica de la lacasa de seta ostra NRC 620 y evaluación de su eficacia en la clarificación del zumo de manzana.

Después de 25 días de incubación estática a 28 °C, la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC620 mostró la mayor actividad en el medio de cultivo fúngico. Los valores óptimos de pH y temperatura para esta enzima fueron 3,0 y 70 °C, respectivamente. Después de 2 horas de incubación a 40 °C y 50 °C, la actividad enzimática se mantuvo en un 68,33 % y un 59,61 %, respectivamente. Después de 2 horas de incubación en tampón citrato-fosfato (pH 7,0), la actividad enzimática se mantuvo en el 100 %. La adición de 10 mM de MgSO₄ y CuSO₄ aumentó la actividad enzimática en aproximadamente un 21 % y un 35 %, respectivamente, mientras que NaCl, MnCl₂, KCl y CaCl₂ la inhibieron. Utilizando ABTS como sustrato, los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 fueron 1,99 mM y 16 217 μmol min⁻¹ L⁻¹, respectivamente. El tratamiento enzimático de las muestras de zumo de manzana redujo significativamente tanto el pH como la viscosidad, y esta reducción se correlacionó con un aumento del tiempo de almacenamiento. El tratamiento con lacasa produjo una ligera disminución del contenido total de fenoles en el zumo de manzana, pero no se observó reducción de la actividad antioxidante.
En los últimos años, los investigadores se han centrado en la aplicación de la biotecnología verde en la industria alimentaria. La lacasa es una de las enzimas más útiles en este sector, con aplicaciones en áreas como el procesamiento de zumos, la panadería, la estabilización del vino y la mejora de las cualidades organolépticas de los alimentos.¹Muchas plantas superiores y microorganismos secretan lacasa,²y hongos como los deuteromicetos, los ascomicetos y los basidiomicetos también pueden producir lacasa.³La lacasa (EC 1.10.3.2) es una oxidasa azul que reduce el oxígeno molecular a agua mediante un sistema compuesto por tres átomos de cobre diferentes, oxidando así diversos compuestos fenólicos y aminas aromáticas. Durante la producción de zumos de frutas y verduras, el pardeamiento enzimático y no enzimático son problemas críticos.⁴Dado que estas sustancias afectan negativamente al color, el sabor y el aroma del zumo, deben eliminarse.⁵
De todas las frutas, la manzana es la más consumida en todo el mundo y en la Unión Europea. En 2019, la producción de manzanas ocupó el tercer lugar a nivel mundial, superando los 87 millones de toneladas.⁶Las manzanas contienen numerosos compuestos fenólicos, entre ellos flavonoides y ácidos fenólicos como el ácido cafeico y el ácido clorogénico.⁷Debido a que el jugo de manzana se consume generalmente en su forma transparente, aproximadamente entre el 50% y el 90% de los componentes fenólicos se pierden durante el proceso de filtración.⁸Hoy en día, los consumidores tienden a elegir productos mínimamente procesados, como el jugo de manzana turbio con alto contenido de polifenoles. Sin embargo, debido a su alto contenido fenólico, este tipo de jugo de manzana es particularmente susceptible a la decoloración y el oscurecimiento.⁹Se utilizan diversas tecnologías, incluidos métodos de tratamiento térmico como la pasteurización a 60-90 °C, para reducir o prevenir el oscurecimiento del zumo de manzana.¹⁰Sin embargo, según una investigación de Sauceda-Gálvez¹¹El procesamiento térmico puede destruir compuestos químicos volátiles y afectar las cualidades organolépticas del jugo de manzana. Entre las alternativas a los métodos de procesamiento térmico se incluyen el dióxido de carbono supercrítico, la radiación ultravioleta, los ultrasonidos, la alta presión hidrostática o la homogeneización a alta presión.¹²La eficiencia de estas tecnologías y el rendimiento de zumos de frutas adecuados dependen de los parámetros utilizados y de las características del producto. Su uso generalizado se ve limitado por los altos costes, los efectos adversos sobre la calidad de algunos productos alimenticios o la inactivación enzimática insuficiente.^13,14
La lacasa se puede utilizar para estabilizar y clarificar el zumo de frutas.¹⁵Gökmen y otros.¹⁶Se recomienda el uso de lacasa para la clarificación de zumos de frutas, ya que elimina eficazmente los compuestos fenólicos al convertirlos en polímeros u oligómeros que se eliminan fácilmente con cualquier membrana de ultrafiltración, lo que permite que el zumo de manzana mantenga un color y una claridad estables hasta por seis semanas a 50 °C. La lacasa purificada de *Trichoderma* se inmovilizó en perlas de alúmina y se utilizó para eliminar selectivamente los compuestos que causan sabores extraños debido a la contaminación microbiana del zumo de manzana.¹⁷
Aproximadamente entre el 80% y el 90% de los componentes volátiles del zumo de manzana son ésteres y aldehídos, que le confieren un aroma único.¹⁸La lacasa de *Trametes versicolor* se inmovilizó sobre un soporte económico hecho de fibra natural de cáscaras de coco jóvenes para la clarificación del jugo de manzana.¹⁹Estudios previos han investigado la estabilización del zumo de manzana (color y turbidez) utilizando métodos sin enzimas o de inmovilización, o en combinación con ultrafiltración.^5,19Sin embargo, el efecto de las lacasas fúngicas en las propiedades fisicoquímicas del jugo de manzana durante el almacenamiento sigue sin estar claro. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar experimentalmente los cambios en las propiedades fisicoquímicas, el contenido de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante del jugo de manzana después del tratamiento con lacasas fúngicas y dos semanas de almacenamiento refrigerado. Las lacasas tienen la capacidad de oxidar compuestos fenólicos, lo que las hace prometedoras para su uso en diversos procesos industriales, incluida la clarificación del jugo. Este estudio examinó las lacasas de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, centrándose en las condiciones ideales para su actividad y eficacia en la clarificación del jugo. Si bien la investigación sobre las setas ostra (P. ostreatus NRC 620) aún es limitada, estudios previos han examinado enzimas de diversas fuentes fúngicas, como Trametes versicolor y Ganoderma lucidum. El objetivo de este estudio fue evaluar la aplicación potencial de esta enzima en la industria alimentaria y destacar sus propiedades únicas, en particular su pH y temperatura ideales.
El ácido 2,2′-azooxibis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) se adquirió de Sigma-Aldrich (Canadá). Todos los demás reactivos eran de grado analítico.
El Centro de Colección de Cultivos Microbianos del Centro Nacional de Investigación obtuvo la cepa conocida de hongo ostra NRC620. Después del subcultivo, esta cepa se almacenó en tubos de agar dextrosa de patata inclinados a 4 °C. El método de preparación del inóculo fue el siguiente: micelio completamente desarrollado de 10 días de edad se inoculó en placas de agar dextrosa de patata y se incubó a 28 °C. Después de 10 días, se extrajeron tres bloques de micelio de 12 mm de diámetro del medio de agar utilizando un punzón de metal estéril y se colocaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml con tapones de algodón que contenían 50 ml de medio de cultivo esterilizado (pH 5,0, como se describió previamente por Othman et al.²⁰Los cultivos se incubaron a 28 °C durante 18 días. Posteriormente, se filtraron a través de papel de filtro Whatman n.° 1, y el sobrenadante resultante sirvió como fuente de enzimas.
La actividad de la lacasa se determinó utilizando ABTS como sustrato. La mezcla de reacción (2 mL) contenía 500 μL de ABTS 0,3 mM (disuelto en tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5) y la cantidad necesaria de muestra de enzima diluida con agua destilada.^21,22Considerando que la lacasa puede oxidar ABTS a temperatura ambiente (28 °C ± 2), la oxidación de ABTS se determinó midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) utilizando un espectrofotómetro UV Agilent Carry-100. Se requirió una unidad de actividad de lacasa para oxidar 1 μmol de ABTS por minuto. La concentración de proteína se determinó mediante el método de Bradford utilizando albúmina de suero bovino como control interno.^23,24
Tras obtener la enzima de la cepa de seta ostra NRC 620, se midió su actividad a diferentes intervalos de cultivo durante 25 días en condiciones estáticas a 28 °C.
Para estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la lacasa, se realizaron experimentos en un rango de temperatura de 20 a 90 °C. Antes de añadir la enzima e iniciar la reacción, se mezclaron el tampón (citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5) y el sustrato (ABTS), y se incubaron durante 5 minutos a diferentes temperaturas. La estabilidad térmica de la enzima se evaluó mediante incubación en tampón de fosfato de sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 y 70 °C durante 2 horas, respectivamente. Posteriormente, se evaluó la actividad residual utilizando el sustrato ABTS.
Se evaluó el efecto del pH sobre la actividad de la lacasa utilizando ABTS como sustrato en tampones de citrato-fosfato 0,1 M con un rango de pH de 2,5 a 7,0. La solución enzimática se incubó a 40 °C durante dos horas en tampones de citrato y Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 y 7) para evaluar la estabilidad del pH. La actividad residual con ABTS como sustrato se calculó después de la incubación.
La lacasa se incubó durante 10 minutos en tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) que contenía diversos iones metálicos (Mg²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, K⁺, Na⁺ y Mn²⁺) a concentraciones de 2,5 mM y 10 mM, respectivamente. A continuación, se añadió el sustrato (ABTS) para iniciar la reacción y se evaluó la actividad relativa.
Se midió la oxidación de ABTS por lacasa a diversas concentraciones (0,025–3 mM) a pH 4,5 para determinar los parámetros cinéticos (Vmax y Km). La cinética^constantesLas ecuaciones de Michaelis-Menten se calcularon mediante un gráfico de Lineweaver-Burk, que representa el recíproco de la velocidad de reacción en función de la concentración del sustrato. Las constantes cinéticas se calcularon a partir del gráfico de Lineweaver-Burk utilizando el software GraphPad Prism versión 6.01.
Tras lavar bien las manzanas con agua del grifo, se cortaron por la mitad y se exprimieron con una licuadora automática Braun MP80 (fabricada en Alemania). El zumo se filtró a través de cuatro capas de gasa. Al grupo de control no se le añadieron enzimas, mientras que al zumo de manzana recién preparado se le añadió un 2,0 % de lacasa (la concentración más eficaz probada), que posteriormente se almacenó a 4 °C durante dos semanas.
La acidez titulable (AT) y el pH se determinaron según el método de Boulton et^al.27El pH de cada muestra se midió utilizando un medidor de pH digital (medidor de pH JENWAY 3510). La acidez titulable (AT) se calculó en función del ácido málico utilizando la siguiente fórmula.
Donde V y C son el volumen (mL) y la concentración (0,1 mol/L) de la solución de hidróxido de sodio utilizada en la titulación, respectivamente. K es el coeficiente de conversión del ácido málico, igual a 0,067, y W es la masa (g) de jugo de manzana.
Los sólidos solubles totales (^TDSEl contenido de todos los zumos se determinó con un refractómetro de bolsillo PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japón). Tras cada medición, se enjuagó la lente óptica con agua desionizada y cada muestra de zumo de manzana se analizó tres veces. El valor de cada muestra se calculó promediando las tres mediciones. La media ± desviación estándar de cada muestra de zumo de manzana también se calculó promediando estos resultados.
La viscoelasticidad de las muestras de jugo de manzana se evaluó utilizando un viscosímetro rotacional (RV, Rheotest 2, Alemania). La muestra se colocó dentro del cilindro “S2” del viscosímetro. La viscosidad aparente se representó mediante la pendiente de la curva de esfuerzo cortante frente a velocidad de corte, la cual se calculó a partir del esfuerzo cortante y las curvas correspondientes a diversas velocidades de corte (de 1,00 a 437,4 s⁻¹). La fórmula para calcular la viscosidad aparente es la siguiente:
Donde η es la viscosidad aparente (cP), τ es el esfuerzo cortante (dyn/cm²), γ es la velocidad de corte (sec⁻¹), y (τ) se calcula utilizando los valores de torque (α) y cilindro (Z) mediante la siguiente fórmula: τ = Z . α.
El índice de pardeamiento se determinó según el método de Meidav ​​et^al.29Se centrifugó una muestra de jugo de 10 ml a 2750 xg durante 10 minutos. Se mezclaron 5 ml del sobrenadante del jugo con 5 ml de etanol al 95 %. La absorbancia de la mezcla se midió a 420 nm utilizando un espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC).
El contenido fenólico total (CTF) se determinó colorimétricamente utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu como lo describieron Boulton et al.^[27]. Se construyó una curva estándar de ácido gálico para concentraciones de 0 a 500 mg/L (^r²= 0,997). Los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico (mg EAG/mL).
Agregue 125 μL de agua destilada y 2850 μL de solución FRAP a 25 μL de jugo de manzana y deje la mezcla en la oscuridad durante³⁰min. Luego mida la absorbancia a 593 nm usando un espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). El reactivo FRAP se preparó mezclando 300 mM de tampón de acetato (pH 3,6), 20 mM de cloruro de hierro(III) y 10 mM de 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (disuelta en 40 mM de HCl) en una proporción de 10:1:1. Se generó una curva estándar usando Trolox como estándar (^R²= 0,999), y los resultados se expresan en μM Trolox/mL.
Se determinó la actividad antioxidante de los zumos tratados y no tratados mediante el método DPPH para evaluar su capacidad de eliminar los radicales libres DPPH.³¹Se mezclaron diez microlitros de jugo con 1 ml de una solución de DPPH (100 μM) en metanol. Después de la reacción en la oscuridad durante 30 min, se midió la absorbancia de la mezcla a 517 nm utilizando un espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). Los resultados se expresaron como equivalentes de trolox (μM trolox/ml) basándose en una curva de calibración (_^R2= 0,990).
Los datos obtenidos mostraron que la producción máxima de lacasa se observó en los hongos ostra NRC 620 al final del día 18 de fermentación, alcanzando una actividad de 1302 U/L. Esto sirvió de base para determinar el tiempo óptimo de cultivo para la producción de lacasa (Figura 1). Si bien la producción de la enzima aumentó con el tiempo de cultivo, la tasa de aumento no fue directamente proporcional a este; después de 21 días, la actividad enzimática solo había aumentado en 90 U/L (hasta 1390 U/L). Por lo tanto, se seleccionaron 18 días como el tiempo óptimo de cultivo para equilibrar el rendimiento del producto con los beneficios económicos de un mayor tiempo de cultivo.
Efecto del tiempo de cultivo en el rendimiento de lacasa en Pleurotus ostreatus NRC 620. Se inocularon tres bloques de micelio fúngico (12 mm) en 50 ml de medio estéril y luego se cultivaron a 28 °C durante diferentes períodos de tiempo.
En consonancia con otros estudios, nuestros resultados indican que el período de cultivo ideal para alcanzar la máxima secreción de lacasa por parte de los hongos probablemente se sitúe entre 7 y 36 días.³²Según Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 produjo la mayor cantidad de lacasa al final del noveno día de fermentación, con una actividad específica de 1637 U/mg de proteína. Además, Othman et al.³⁴Se observó que *Trichoderma harzianum* S7113 secretaba una gran cantidad de lacasa al quinto día de cultivo. La tasa de producción de lacasa alcanzó su máxima actividad al decimocuarto día y luego disminuyó gradualmente.³⁴Aunque la secreción de enzimas también puede producirse durante la fase principal de crecimiento, suele alcanzar su punto máximo durante la fase intermedia y se desencadena por el consumo de una fuente de carbono o nitrógeno.^34,35
Aunque la lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620 mostró una alta actividad en un amplio rango de temperaturas, desde 50 °C hasta 80 °C, alcanzando su actividad máxima (69-98 %), esta se observó a 70 °C (Fig. 2a). Fuera de este rango, la actividad enzimática disminuyó aproximadamente a 70 °C. Estos resultados sugieren que la enzima es activa a altas temperaturas, probablemente debido a que estas incrementan la energía cinética de la reacción.
Efecto de la temperatura de reacción (a) y del pH (b) sobre la actividad de la lacasa en *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Se alcanzaron temperaturas de entre 20 y 90 °C mediante la preincubación de la mezcla a diferentes temperaturas durante 5 minutos antes de añadir la enzima e iniciar la reacción. El efecto del pH sobre la actividad de la lacasa se evaluó utilizando ABTS como sustrato en soluciones que contenían tampón citrato-fosfato 0,1 M en un rango de pH de 2,5 a 7,0.
Según Ezike y^al.33, la temperatura óptima para la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 es de 55 °C, que es la misma que para *Ganoderma lucidum*.^lacasa36y similar a la temperatura óptima (50 °C) para *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lacasa . ^Baldrian38Se señala que, al igual que para otros sistemas enzimáticos que degradan la lignina, el rango de temperatura ideal para la lacasa está entre 50 y 70 °C.
Los resultados mostraron que la enzima exhibió la actividad más alta a pH 3.0, alcanzando el 94% de actividad a pH 3.5. Sin embargo, se mantuvo activa en un amplio rango de pH de 2.5 a 7.0 (Figura 2b). Además, exhibió mayor actividad en condiciones ácidas en comparación con condiciones neutras o alcalinas. Su actividad se mantuvo al menos en un 77% en el rango de pH de 2.5 a 4.5, pero solo alcanzó aproximadamente el 38% a pH 7.0. El pH óptimo para la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 fue 4.533, que es el mismo que el pH para las lacasas de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 y *Trametes hirsuta* 41. Sin embargo, según el estudio de Chairin et al.⁴²El pH óptimo para la lacasa de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 es 2,2, mientras que el pH óptimo para la lacasa de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 es 5,043. La unión de aniones hidróxido (inhibidor de la lacasa) a los átomos de cobre de la lacasa T2/T3 puede ser la razón de la disminución de la actividad de la lacasa en condiciones de pH neutro o alcalino. Esto puede interrumpir la transferencia interna de electrones del centro T1 al centro T2/T3, por lo tanto^limitarla actividad enzimática23,44
Al incubar la enzima a diferentes temperaturas, se observó que tanto el tiempo como la temperatura de incubación afectaban su estabilidad. En particular, la lacasa de *Trametes polyzona* NRC 620 mostró mayor estabilidad a 40 °C y 50 °C, conservando el 68,33 % y el 59,61 % de su actividad inicial, respectivamente, tras 120 minutos (Figura 3a). Por el contrario, en las mismas condiciones (40 °C y 50 °C, 120 minutos), la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 conservó el 64,38 % y el 42,92 % de su actividad, respectivamente.³³Por el contrario, el aumento del tiempo y la temperatura de incubación disminuyó la estabilidad de la lacasa de *Trametes polyzona* NRC 620; tras la incubación a 60 °C y 70 °C durante 60 minutos, su actividad disminuyó al 39,24 % y al 1,72 %, respectivamente (Figura 3a). En consonancia con los resultados experimentales, la lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 mostró mayor estabilidad a 40 °C y 50 °C durante todo el proceso de tratamiento térmico.³³De manera similar, Lueangjaroenkit y^al.37y Chairin y^al.42Se informó sobre la estabilidad de las lacasas de Trametes polyzona KURNW027 y Trametes polyzona WR710-1 a 50 °C durante 1 hora, respectivamente. Como biocatalizador útil aplicable en diversos campos biotecnológicos, la lacasa debe tener buena estabilidad y rendimiento en un amplio rango de temperaturas.
Estabilidad termostática (a) y estabilidad de pH (b) de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620. La estabilidad termostática se evaluó incubando la solución enzimática en tampón de fosfato de sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 y 70 °C durante 2 h, respectivamente. La estabilidad de pH se evaluó incubando la solución enzimática en tampón de citrato 0,1 M y tampón Tris (pH 3, 4, 6 y 7) a 40 °C durante 2 h. La actividad residual se calculó utilizando ABTS como sustrato después de la incubación.
Para determinar las condiciones óptimas para el uso y almacenamiento de la enzima, investigamos el efecto del pH en la estabilidad de la lacasa. La exposición a diferentes valores de pH afectó significativamente la estabilidad de la estructura proteica, influyendo así en la estabilidad y actividad de la molécula enzimática. Los resultados mostraron que la enzima era menos estable en condiciones ácidas, mientras que demostró mayor estabilidad a valores de pH más altos (regiones neutras y alcalinas). A valores de pH de 7,0, 6,0, 4,0 y 3,0, las tasas de retención de la enzima después de 120 minutos fueron aproximadamente 100%, 62,54%, 52,39% y 11,14%, respectivamente (Fig. 3b). La lacasa *Strombus multisus* WRF03 mostró mayor estabilidad a valores de pH neutros (5,5–6,5) y menor estabilidad a valores de pH ácidos (por debajo de 4,0). Tras 120 minutos a valores de pH de 5,5, 6,0 y 6,5, las tasas de retención de la enzima fueron aproximadamente del 82%, 100% y 93%, respectivamente.³³Khairin y otros.⁴²Se observó que la lacasa de Trametes polyzona WR710-1 era estable en el rango de pH de 6,0 a 7,0, mientras que Sayed et al.⁴⁵Se demostró que la lacasa era más estable en condiciones de pH neutro. Sin embargo, la lacasa de Cerrena unicolor también mostró estabilidad en condiciones alcalinas (pH 9,0).⁴⁶Las lacasas estudiadas mostraron una alta estabilidad en un amplio rango de pH. Esta característica puede ser importante para aplicaciones industriales.
Dado que algunos iones metálicos tienen efectos tanto estimulantes como inhibidores sobre la actividad enzimática, es fundamental considerar sus efectos en las aplicaciones industriales. Esto es crucial, ya que los iones metálicos son contaminantes ambientales comunes que pueden afectar la estabilidad y la síntesis de enzimas extracelulares.⁴⁷Para investigar los efectos de múltiples iones metálicos sobre la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, realizamos los experimentos correspondientes. Como se muestra en la Figura 4, dependiendo del tipo de metal utilizado, el aumento de la concentración de iones metálicos de 2,5 mM a 10 mM afectó negativamente la función de la enzima. Por ejemplo,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, y^Cu²⁺podría estimular y activar la actividad enzimática, mientras que^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, y^K⁺podrían inhibir la actividad enzimática. A una concentración de 10 mM, los iones Cu²⁺ y Mg²⁺ fueron los activadores más potentes de la actividad de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proporcionando un grado de activación de aproximadamente el 34 % y el 20 %, respectivamente. Sin embargo, a una concentración de 10 mM, los iones Ca²⁺ fueron el inhibidor más potente de la lacasa, reduciendo la actividad enzimática en aproximadamente un 60 %.
Efecto de los iones metálicos sobre la actividad de la lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620. La lacasa se incubó durante 10 minutos en tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) que contenía diversos iones metálicos a concentraciones de 2,5 mM y 10 mM. Posteriormente, se inició la reacción mediante la adición del sustrato (ABTS), tras lo cual se midió la actividad relativa.
Nuestros resultados son consistentes con los de otros autores que encontraron que Mg²⁺ y Cu²⁺ mejoran la actividad de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ encontraron que la lacasa de *Xylaria* sp. es estimulada en cierta medida por iones de cobre (Cu²⁺). Además, Foroutanfar et al.⁴⁹ y Si et al.⁵⁰ realizaron estudios similares sobre lacasas de *Paraconiothyrium variabile* y *Trametes pubescens*, respectivamente. El sitio de unión al cobre de tipo II (T2) de esta enzima puede saturarse con Cu²⁺ a una concentración dada, lo que puede explicar la estimulación de la actividad de la lacasa a concentraciones más altas de Cu²⁺³⁹. Dado que las lacasas de los hongos de podredumbre blanca son oxidasas que contienen múltiples átomos de cobre, los efectos de los iones de cobre sobre la actividad de la lacasa son diversos y varían desde estimulantes e inhibidores hasta neutros.⁵¹ En contraste, Zhou et al.^{. [52]}informó que^Cu²⁺inhibió la actividad de la lacasa de la termita subterránea de Taiwán (Odontotermes formosanus). Sin embargo, las lacasas de Cerena sp. HYB07^[53]y Clitocybe maxima^[54]No se vieron afectados por los iones de cobre.
La especificidad del sustrato estuvo representada por sus parámetros cinéticos (Km y Vmax); cuanto mayor sea la afinidad de unión del sustrato a la enzima, menor será el valor de Km y mayor la especificidad del sustrato.^3,21,55Los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 se determinaron utilizando el software GraphPad Prism 6.0 mediante la representación gráfica de Lineweaver-Burk (Figura 5). Al utilizar ABTS como sustrato, los resultados fueron 1,99 mM y 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}respectivamente. Elsayed et al.²¹Se informó que los valores de Km para la oxidación de ABTS fueron 0,1 mM y 0,064 mM, respectivamente, lo que indica una alta afinidad de las isoenzimas Lac A y Lac B por ABTS. Además, los valores de Vmax fueron 0,182 μmol.^min⁻¹y 0,603 μmol^min⁻¹, respectivamente. El valor de Km obtenido fue menor que el de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); además, su valor de Vmax (1429 mmol min⁻¹) también fue^{más bajo}cuando se utiliza ABTS como sustrato.33 De manera similar, los valores de Km de las concentraciones de lacasa de Lentinus squarrosulus MR13 y Trametes sp. AH28-2 fueron 0,0714 mM y 0,025 mM, respectivamente, y los valores de Vmax fueron 0,0091 mM min−1 y 0,67 mM min−1 mg−1 (en relación con ABTS).^{, respectivamente.56,57}
Se investigó el efecto de la concentración de ABTS sobre la actividad de la lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 y se elaboró ​​un gráfico de Lineweaver-Burk del inverso de la velocidad de reacción inicial frente a la concentración de ABTS. La reacción de oxidación de ABTS con diferentes concentraciones (0,025–3,0 mM) de lacasa se midió a pH 4,5 para determinar los parámetros cinéticos (Vmax y Km). Las constantes cinéticas de Michaelis-Menten se calcularon utilizando el gráfico de Lineweaver-Burk del inverso de la velocidad de reacción frente a la concentración del sustrato. Las constantes cinéticas se calcularon a partir del gráfico de Lineweaver-Burk utilizando el software GraphPad Prism 6.01.
Las enzimas clarificantes tradicionales, como las pectinasas, hidrolizan las sustancias pécticas, reduciendo la viscosidad y la turbidez. Descomponen eficazmente los polisacáridos estructurales y suelen utilizarse en combinación con otras enzimas, como las celulasas y las hemicelulasas, para mejorar el rendimiento y la claridad. Sin embargo, las pectinasas no actúan específicamente sobre los compuestos fenólicos, que son los principales responsables de la turbidez y el pardeamiento oxidativo, especialmente en zumos como el de manzana y el de uva.⁵⁸En cambio, las lacasas catalizan la oxidación de los compuestos fenólicos, polimerizándolos en moléculas más grandes e insolubles que pueden eliminarse mediante sedimentación o filtración. Este mecanismo no solo mejora la claridad, sino que también prolonga la vida útil del zumo al reducir la probabilidad de que se produzca un oscurecimiento oxidativo causado por los compuestos fenólicos. Además, los procesos de clarificación basados ​​en lacasas pueden llevarse a cabo en condiciones de procesamiento suaves (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), lo que los hace adecuados para zumos delicados sin comprometer sus propiedades nutricionales u organolépticas.⁵⁹Los estudios han demostrado que el tratamiento con pectinasa puede clarificar el jugo en 1-2 horas, mientras que el tratamiento con lacasa generalmente requiere un tiempo de reacción más prolongado (3-6 horas) para reducir completamente los compuestos fenólicos. Sin embargo, este proceso puede optimizarse inmovilizando la enzima o combinando la lacasa con métodos de clarificación mecánica.⁶⁰En este estudio, el análisis enzimático del extracto crudo reveló una actividad significativa de lacasa y α-amilasa, mientras que la actividad de pectinasa y xilanasa fue extremadamente baja y no se detectó actividad de celulasa. Por lo tanto, la reducción de la turbidez y del contenido fenólico se debió principalmente a la acción de la lacasa, mientras que el cambio en la viscosidad podría deberse en parte a la acción de la amilasa.
La Tabla 1 muestra los parámetros fisicoquímicos del jugo de manzana recién exprimido y de las muestras tratadas con lacasa. Los resultados mostraron que el rendimiento del jugo de manzana recién exprimido (71,59%) fue menor que el de las muestras tratadas con lacasa (87,34%). Estos resultados son consistentes con los hallazgos de Pilnik y Orange.⁶¹, quien indicó que el uso de enzimas en el procesamiento de frutas puede aumentar el rendimiento del jugo, mejorar la filtración y obtener un jugo claro y de alta calidad para su concentración. El aumento en el rendimiento del jugo se debe principalmente al aumento en el contenido de azúcares solubles en el jugo. Durante la hidrólisis enzimática de las frutas, la mesoglea y la pectina en las paredes celulares del producto se destruyen y se convierten en sustancias solubles como azúcares neutros y ácidos.^62.El valor de pH del jugo de manzana tratado con enzimas fue significativamente menor que el del grupo control (P < 0,05), y el valor de pH de ambos grupos aumentó significativamente durante el almacenamiento (Tabla 1). Estos resultados son consistentes con los de Mark et al.⁶³, quienes observaron que el pH del jugo de anacardo disminuyó tras el almacenamiento y el tratamiento térmico. La degradación de la pectina y la formación de ácido galacturónico tras el tratamiento enzimático podrían ser responsables del aumento del pH durante el almacenamiento. El pH de las muestras tratadas con enzimas se mantuvo entre 4,05 y 4,31 durante todo el almacenamiento, mientras que el pH del jugo de manzana sin tratar osciló entre 4,12 y 4,33.
La acidez total (AT) de las muestras, tanto sin tratar como tratadas con lacasa, mostró una tendencia decreciente con el aumento del tiempo de almacenamiento (Tabla 1). Esta disminución de la acidez se atribuyó a la conversión de ácidos orgánicos en carbohidratos o a reacciones enzimáticas, así como a la oxidación durante el almacenamiento del jugo.⁶⁴La acidez total del zumo de manzana de control y de las muestras tratadas con enzimas fue menor que la de otros zumos (zumo de fresa 0,9 %, zumo de ciruela 2,2 %, zumo de kumquat 1,0 %, zumo de albaricoque 2,4 %, zumo de naranja 0,8 %), pero similar a la de otros zumos (por ejemplo, zumo de pera 0,3 %).⁶²Estas diferencias en el zumo de manzana recién exprimido sin tratar pueden deberse a diversos factores, como las condiciones de cultivo, los factores genéticos, el nivel de madurez y los métodos de procesamiento.⁶⁵La disminución de la acidez total del jugo de manzana de control y del tratado con lacasa es consistente con los resultados presentados por Singh et al.⁶⁶respecto a la disminución de la acidez total del jugo de manzana Jin Nuo después de 74 días de almacenamiento. Por otro lado, Oshmiansky y Wojdylo⁶⁷No se observaron cambios significativos en la acidez del zumo de manzana al estudiar el efecto de los métodos de clarificación tradicionales.
Los resultados presentados en la Tabla 1 indican que el valor de sólidos solubles totales (SST) del jugo de manzana tratado con lacasa fue mayor que el de la muestra no tratada. Estos resultados son consistentes con los estudios publicados.^{. 68}Además, la Tabla 1 muestra que el valor de SST del grupo de jugo de manzana de control fue de 9,58 en el punto de tiempo inicial y alcanzó 11,05 al final del período de almacenamiento. Estos valores son inferiores a los valores de SST del jugo de manzana fresco reportados por Hamid et al.^{. 69}(11,2 y 11,80, respectivamente). El valor de SST de las muestras de jugo de manzana tratadas con lacasa aumentó significativamente, comenzando desde 11,23 y alcanzando 12,93 después de dos semanas de almacenamiento a 4 °C (Tabla 1). Un aumento similar en SST durante el almacenamiento también se observó en frutas cítricas, limones y naranjas dulces. El aumento en sólidos solubles totales (SST) durante el almacenamiento puede deberse a la hidrólisis de polisacáridos (almidón) a monosacáridos (azúcares), el aumento en la concentración debido a la deshidratación del jugo y la degradación de la pectina en el jugo a sólidos solubles. El aumento en sólidos solubles totales (SST) es probable que se deba al aumento en azúcares solubles, que pueden formarse por la conversión de pectina o celulosa a azúcares solubles por pectina o celulasa, respectivamente, o por la hidrólisis de almidón a azúcares, como informaron Hamed et al.^69.El efecto de la lacasa en las propiedades del jugo de manzana se puede observar visualmente, ya que el jugo tratado con lacasa presenta mejor fluidez y menor viscosidad que el jugo sin tratar. Esta observación se registra en la Tabla 1; la viscosidad de la muestra tratada con la enzima fue de 1,87 cP, mientras que la de la muestra de control fue de 2,95 cP. Esta disminución significativa de la viscosidad probablemente se deba a la mayor capacidad de retención de agua de las sustancias similares a la pectina y a la formación de una estructura de red cohesiva.
En este estudio, se investigó el efecto de la lacasa sobre el índice de pardeamiento (IP) del jugo de manzana midiendo la absorbancia a 420 nm con un espectrofotómetro. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Durante el almacenamiento, el IP de las muestras de jugo de manzana en los grupos tratados y no tratados mostró una tendencia de aumento gradual. El IP refleja el grado de pardeamiento y puede servir como^{un importante}indicador de reacciones de pardeamiento enzimático y no enzimático. La absorbancia aumentó significativamente durante el almacenamiento (P < 0,05). Al final del almacenamiento, la_A420El valor de las muestras de jugo de manzana en los grupos de control y tratados con enzimas aumentó en aproximadamente un 217 % y un 121 %, respectivamente (Tabla 1). Los resultados indican que el tratamiento con enzimas puede reducir eficazmente el grado de pardeamiento en aproximadamente un 56 %. Los resultados de Bezerra et al.^[19] son ​​consistentes con nuestros resultados; utilizaron lacasa-glutaraldehído-fibra de coco para clarificar el jugo de manzana, reduciendo su color original en un 61%.
Si bien los polifenoles presentes en los zumos de frutas tienen efectos nutricionales y terapéuticos positivos para el cuerpo humano, también pueden reaccionar con las proteínas, provocando turbidez, sedimentación o enturbiamiento del zumo, lo que altera el sabor y el aroma del producto y reduce su vida útil.⁷¹El objetivo de este estudio fue reducir de forma segura el contenido de compuestos fenólicos del jugo de manzana utilizando lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620. Los resultados presentados en la Tabla 1 muestran que el contenido total de compuestos fenólicos del jugo de manzana tratado con lacasa se redujo significativamente antes del almacenamiento a 4 °C. Además, el contenido total de compuestos fenólicos también disminuyó durante el almacenamiento en ambas muestras estudiadas (Tabla 1). Investigación de Sandri et al.⁷²demostraron que el jugo de manzana tratado con enzimas puede conservar su actividad antioxidante y su contenido de compuestos fenólicos. Sin embargo, los resultados de un estudio de Lettera et al.⁷³Los estudios demuestran que el tratamiento del zumo de naranja con lacasa fúngica puede reducir el contenido de compuestos fenólicos hasta en un 45%.
Se ha demostrado que los compuestos fenólicos poseen propiedades como la eliminación de radicales libres, la reducción y desactivación del oxígeno singlete, la transferencia de átomos de hidrógeno y la donación de electrones a los radicales libres, lo que los convierte en potentes antioxidantes.⁷⁴Por lo tanto, en este estudio se utilizaron los métodos DPPH y FRAP para evaluar el efecto de la lacasa sobre la actividad antioxidante del jugo de manzana almacenado en refrigeración durante 14 días (Tabla 2). Ambos métodos mostraron un aumento en la actividad antioxidante durante el almacenamiento, lo que puede deberse al incremento de compuestos fenólicos libres o a la formación de productos de la reacción de Maillard (PRM), siendo estos últimos probablemente la causa del aumento en la actividad antioxidante.⁷⁵Las reacciones de pardeamiento no enzimático (que incluyen la degradación del ácido ascórbico, las reacciones de Maillard y la degradación de azúcares catalizada por ácidos) producen pigmentos marrones (melanoidinas). Los productos intermedios de la degradación del ácido ascórbico y los productos de la degradación de los azúcares (como los compuestos carbonílicos) pueden reaccionar con los aminoácidos mediante reacciones de Maillard.⁷⁶Aunque el oscurecimiento de las frutas y verduras durante el almacenamiento ha sido ampliamente estudiado, nuestro conocimiento de estas reacciones sigue siendo limitado.⁷⁷En comparación con el método FRAP, el jugo de manzana tratado con lacasa mostró una actividad antioxidante significativamente menor según el método DPPH (Tabla 2), y la actividad antioxidante de todas las muestras aumentó significativamente con el tiempo de almacenamiento. En este estudio se utilizaron dos métodos diferentes para determinar la actividad antioxidante debido a que sus principios difieren. El método DPPH mide la capacidad de neutralizar radicales libres, mientras que el método FRAP mide la capacidad de reducir iones de hierro. Por lo tanto, se recomienda utilizar múltiples métodos para determinar la actividad antioxidante y así comprender mejor la actividad antioxidante de las muestras estudiadas.⁷⁸
Uno de los hallazgos clave de este estudio es que la lacasa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 exhibe una actividad óptima a 70 °C y pH 3.0. En comparación con otras lacasas fúngicas comúnmente utilizadas para la clarificación de jugos, como las lacasas de *Trametes versicolor* y *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 exhibe una mayor estabilidad térmica y un pH más ácido. Las lacasas de *Trametes versicolor* y *Ganoderma lucidum* suelen exhibir una actividad óptima en el rango de 50-60 °C y a valores de pH entre 3.5 y 5.0. Esta diferencia puede contribuir a una mayor eficiencia de clarificación de jugos, especialmente para jugos ácidos donde la estabilidad a valores de pH más bajos es crítica. La característica única de *P. En comparación con otras lacasas fúngicas estudiadas, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 exhibe la capacidad de funcionar eficazmente en condiciones más exigentes. Su temperatura óptima de actividad más alta sugiere ventajas potenciales en aplicaciones industriales, como velocidades de reacción más rápidas y una menor contaminación microbiana. Su bajo pH, que se adapta bien a la naturaleza ácida de muchos zumos, puede ser útil en procesos de clarificación de zumos. Estos resultados justifican una mayor exploración para su aplicación a gran escala, lo que convierte a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 en una alternativa viable a las fuentes tradicionales de lacasas fúngicas. En comparación con estudios previos, encontramos que la temperatura óptima es de 60 °C y el pH óptimo es de 3,0. Después de la reacción a 60 °C durante 80 minutos, la lacasa de *Ganoderma lucidum* retuvo⁴⁶% de su actividad.79 Según Kurniawati y Nicelle⁸⁰Las enzimas de *Ganoderma lucidum* exhiben una estabilidad de excelente a moderada a 25 °C y valores de pH que van de 5,0 a 8,0, y estabilidad a pH 6,0 y temperaturas que van de 10 a 30 °C. En este estudio, encontramos que el pH y la temperatura óptimos para la actividad enzimática de *Pleurotus ostreatus* fueron 3,0 y 70 °C, respectivamente. Después de la incubación a 40 °C y 50 °C durante dos horas, la enzima retuvo el 68,33 % y el 59,61 % de su actividad, respectivamente. Además, la lacasa NRC 620 de Pleurotus ostreatus exhibió una alta actividad en un amplio rango de temperatura de 50 °C a 80 °C, alcanzando casi la actividad máxima (69 %-98 %), con la actividad máxima observada a 70 °C.
En conclusión, la lacasa de seta ostra NRC620, obtenida en condiciones estáticas, demostró una actividad y estabilidad óptimas en un amplio rango de pH y temperatura, mostrando una estabilidad superior en comparación con otras fuentes enzimáticas. La adición de 10 mM de MgSO₄ y CuSO₄ incrementó la actividad enzimática en aproximadamente un 21 % y un 35 %, respectivamente. Al procesarse en jugo de manzana, la enzima redujo el pH y la viscosidad, mientras que el contenido fenólico disminuyó solo ligeramente durante el almacenamiento.
Los resultados confirman el potencial de la lacasa en la industria alimentaria, especialmente en la clarificación de bebidas. Al descomponer específicamente los compuestos fenólicos, la lacasa no solo reduce la turbidez y mejora la claridad, sino que también mantiene la calidad de los zumos de frutas en condiciones de operación suaves. A diferencia de los agentes clarificantes tradicionales como la gelatina, la bentonita y el gel de sílice, la lacasa no genera residuos ni elimina los aromas agradables de las bebidas, lo que la convierte en una opción más ecológica y sostenible. Además, en comparación con otras enzimas y métodos de filtración, la lacasa ofrece una solución específica y rentable sin comprometer la calidad del producto.
Kyomuhimbo, HD y Brink, HG. Aplicaciones y estrategias de inmovilización de lacasas que contienen cobre; una revisión. Heliyon 9, e13156 (2023).